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                免疫組化難題——背景染色問題
                文章來源:江蘇大发快三app下载有限公司   添加時間:2020/10/22 17:00:13 點擊率:139

                1、背景染色較深的原因有哪些?

                (1)抗體濃度〓過高:一抗濃度過高是常見的原因之一。解決︼辦法是,每次使用新抗體前應當對其工作濃度進↑行測試,使每一抗體個體化〒,找到適合自己實驗室的理想工作濃度,既使是即用型的抗體卐也應如此,不能只簡單的按說明書進行染色。

                (2)抗體孵育時間過長或溫度較高:解決辦法是,嚴格執行操作規程,最好隨Ψ 身佩帶報時表或報時鐘,及時提醒,避免因遺忘而造成時間▃延長。現在流行的二步法(Polymer)敏感性∞很高,要求一抗孵育的時間不是傳統的 1 小時,而是 30 分鐘,因此,要根據染色結☉果進行調整。

                (3)DAB 變質和顯色時間太長:DAB 最好Ψ現用現配,如有沈渣應進行過濾後再用。配制好的 DAB 不應存放時間太長,因為在沒有酶的情況下,過氧化氫也會遊離出氧原子與 DAB 產生反◣應而降低 DAB 的效力,未用完的 DAB 存放在冰箱裏幾天後再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DAB 的→顯色最好在顯微鏡下監控,達到理想的染色程度時立即終止反應。不過當染色片太多時或用染色機時,這樣做似乎不現實,但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監控,避免顯色時間過長。

                (4)組織變幹:修復液溢出後未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變幹的原因。解決的辦法是操作要認真仔細,采用 DAKO 筆或 PAP Pen 在組織周圍畫□ 圈,可以有效的避免液體流失,也能提高操作速度。

                (5)切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太長(大於 24 小時):原因上不清楚,但現象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復,第二天加抗體進行免疫組化染色,如果將裝有切片和修復液的容器放在 4C 冰箱過夜,對結果無明顯影響,如果放〖在室溫,特別是炎熱的夏天,會出現】背景著色,因此,不可存放時間太長。

                (6)一抗變質、質量差的⊙多克隆抗體:註意抗體的有效期,過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買抗體時最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

                2、蘇木素復染後氨水返藍這一步如何做、濃度多少、時間多長?

                答:返藍可以用堿性溶液(PBS/Na2 HPO4/淡氨水)或 45 度溫水、冷水藍化均可。一般藍化 5~10 min。淡氨水有人用 50 ml 自來水+三四滴的氫氧化銨。

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