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                  正文
                悄悄告訴你ELISA的那些事!!!
                文章來源:江蘇大发快三app下载有限公司   添加時間:2020/4/10 16:27:05 點擊率:90

                我司所提◥供ELISA KIT是典型的雙抗夾心法酶聯免疫吸附測定試劑︼盒。預先將抗體包被在聚苯乙烯上,檢測相抗〓體經生物素(biotin)標記,樣品和生物素標記抗體先後加入酶標板孔∩反應後,PBS或TBS洗滌。隨後加入過氧化物酶標記的親和素反應;經過PBS或TBS的徹◢底洗滌後用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中的目的蛋白呈正相關。

                一、 ELISA反應原理

                ELISA的基ζ礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗♂原或抗體仍保持其免疫√學活性,酶標記的抗原或抗體∏既保留其免疫學活性,又保留酶的活性。在測定時,受檢標本(測定其中的抗體Ψ或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方↙法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗∑體,也通過反應而結合在固相載體〗上。此時固相上「的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物㊣ 後,底物被酶催化成為有色產物,產物的量與標本中受↓檢物質的量直接相關,故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由於酶的催化效率很△高,間接地放大了免疫反應的結果,使測定方法達到∞很高的敏感度。

                二、試劑盒操作步驟

                1.加樣☉本和標準品:將梯度稀釋過的標準品和稀釋的待檢樣品加◆入博士德提供的酶標板中,置37℃ 孵育90min後,棄去孔內溶液。

                2.加生∴物素標記抗體:於各反應孔卐中,加入新鮮稀釋的生物素標▓記抗體

                0.1ml,37℃ 孵育60min,TBS或PBS洗滌3次,每次浸泡60s。

                3. 加親和素-過氧化物酶復∑ 合物:於各反應孔中,加入新鮮稀釋的親和素-過氧化物酶復≡合物0.1ml,37℃ 孵育30min,TBS或PBS洗滌5次,每次浸泡90s。

                4.加底物液顯色:於各反應★孔中加入TMB底物溶液90ul,37℃10~30分鐘。

                5.終止反應:於各反應孔中▼加入終止液100ul。

                6.用酶標儀在450nm測定O.D.值

                三、ELISA常用標本類型及其處理

                血清:用幹〖凈試管收集血液,室溫凝固30分鐘,離心20分鐘左右,收集上清。如有沈澱形○成,應ω 再次離心。

                血漿:根據試劑盒要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,與血液混合10-20分鐘後,離心20分鐘左右,,收集上清。如有沈澱形成,應再次離心。

                尿液、胸腹水、腦脊液:用無菌管【收集,離心20分鐘左右,收集上清。如有沈澱形成,應再次離心。

                細胞培養上清:檢測分◤泌性成分時,用無菌管收集,離心20分鐘左右,收集上清。檢測細胞內成分時▆,用PBS稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融,以使細胞破壞並釋放細胞內成ㄨ分,離心收集上清。如有沈澱形成,應再次離心。

                細胞:檢測細胞成分時,對於貼壁細胞,去除培◎養液,用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍,加入¤適當裂解液,用槍吹打數下,使裂解液和細胞充分接觸。對於懸浮細胞,離心々收集細胞,用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍,加入適當裂解◥液,用槍吹打把細胞吹散。用手指輕彈以充分裂解細◣胞。充分裂解後,10000-14000離心3-5分鐘,取上清,即可進行後續操□作。

                組織標本:切割標本後,稱取重量。加入一←定量的PBS或組織萃取試劑,緩沖液中可加入蛋白酶抑制劑。用手工或勻漿器將標本勻漿充分,離心№收集上清於-20℃或-70℃保存,若有必要,可以將樣品濃縮幹燥。分↓裝後一份待檢測,其余冷凍備用。

                四、註意事項

                1.血清標本采集時,應避免溶〗血,紅細胞溶解時會釋放出具有』過氧化氫酶活性的物質,以HRP為標記的ELISA測定中,溶血標本可能會增加非★特異性顯色。

                2.標本應新鮮時檢測。如有細菌汙染,菌體中可■能含有內源性HRP,也會產生假陽性反應。保存過久可發生聚合在ELISA中≡可使本底加深。

                3.酶標板在操作過程中避免幹燥。幹燥會使酶標板上生物成份迅速失活。4.為免交叉汙染♂,要◥避免重復使用手中的吸頭和試管。

                5.封板溫育時,各孔一定要▂封嚴,防止陽性標本的液體蒸發,產生周邊現象從而導致“花板”的出現。揭封板膜和@覆蓋封板膜時應避免用力過大導致液〒體濺出。

                6.用洗板機洗板時,保證洗@ 液註滿各孔,洗板針暢通,洗完板後最好在吸水紙(選擇幹凈、無或少塵的吸水材♀料)上輕◆輕拍幹:還要防止針口有纖維蛋白或異物,這些異物在洗板的過程中易產生拖帶現象而導致“花板”的出現。

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